PCDHA9
基因突变与
肌萎缩侧索硬化症（ALS）病理机制的相关性研究
肌萎缩侧索硬化症（ALS），亦称运动神经元病（MND），在英国地区常用后者名称，在法国则被称为夏科（Charcot）病，而在美国又常被称作卢伽雷（Lou Gehrig）病。在中国，肌萎缩侧索硬化与运动神经元病这两个术语通常交替使用。此疾病更广为人知的非官方名称为“渐冻人症”。
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种致命的神经退行性疾病，其病理特征是大脑运动皮层、脑干和脊髓中的运动神经元逐步退行性变，最终导致患者瘫痪，很多患者因呼吸衰竭而死亡。诊断后，肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者的平均存活时间通常不超过5年。
肌萎缩侧索硬化症（ALS），在全球范围内的发病率大约是每10万人中有2例，而在西方国家，人群终身患此病的风险大约是300分之一。大部分肌萎缩侧索硬化症（ALS）病例是散发性的，大约10%属于家族性。虽然中国的具体肌萎缩侧索硬化症（ALS）患病率尚未有详细统计，但是来自中国台湾地区的年发病率数据显示每10万人中有0.51例，而中国香港地区的患病率在每10万人中约为0.31至0.6例。与之相比，日本的患病率为每10万人中有2.2例，欧洲为每10万人中有2.16例，显示中国地区的发病率相对较低。在中国的肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者中，仅有1.2-2.7%被诊断为家族性肌萎缩侧索硬化症（ALS），而颅神经核型肌萎缩侧索硬化症（ALS）的患者比例仅占14%。
肌萎缩侧索硬化症（ALS）病因受遗传和环境因素的共同影响。迄今为止，研究者发现了超过120个与肌萎缩侧索硬化症相关的基因，这些基因与肌萎缩侧索硬化症的关联程度不同。尽管一些基因与肌萎缩侧索硬化症的关联证据较弱或有限，但大约有30个基因显示出与家族性肌萎缩侧索硬化症（fALS）和散发性肌萎缩侧索硬化症（sALS）有着明确的强联系。
在所有已知的肌萎缩侧索硬化症相关基因中，C9ORF72、SOD1、TARDBP和FUS这四个基因是最常见的，它们在家族性肌萎缩侧索硬化症病例中的比例约为15%，而在散发性肌萎缩侧索硬化症病例中的比例约为80%。特别值得注意的是C9ORF72基因中的六核苷酸重复扩增（HRE），即（GGGGCC）n，它是肌萎缩侧索硬化症患者中最常见的基因突变类型。不过，这种突变在东亚肌萎缩侧索硬化症患者群体中相对罕见，这揭示了肌萎缩侧索硬化症在不同种族和地理区域的遗传多样性。
在探索肌萎缩侧索硬化症（ALS）的遗传学基础上，我们对一批中国肌萎缩侧索硬化症患者的外显子组进行了深入分析。
在此过程中，我们在三名不相关患者的PCDHA9基因中鉴定出一个同源纯合突变（p.L700P）
。为了进一步研究此基因突变的生物学影响，我们生成了携带该同源点突变或敲除突变的Pcdhα9基因突变小鼠模型。这些小鼠展现了进展性的脊髓运动神经元损伤、肌肉萎缩以及神经肌肉接头的结构与功能异常，这些症状最终导致了瘫痪和预期寿命缩短。在老龄突变小鼠的脊髓运动神经元中，我们还观察到了与TDP-43蛋白病理有关的改变。
小鼠模型已在揭示许多疾病的分子致病机制方面发挥了重要作用。对于肌萎缩侧索硬化症的研究而言，目前大量依赖的是基因过表达小鼠模型。这些模型中的基因表达水平远超正常生理条件，因此它们模拟人类疾病的准确性存疑。仅有部分敲入模型（在正常生理水平下表达突变基因）能够复现肌萎缩侧索硬化症的特征表型。
例如，Matr3基因敲入的小鼠展现了许多类肌萎缩侧索硬化症的重要特征，而Dctn1和Vcp基因敲入的小鼠则复现了肌萎缩侧索硬化症的某些表型。这表明，通过鉴定与肌萎缩侧索硬化症有直接关联的基因，并开发出能够精确重现人类肌萎缩侧索硬化症临床和神经退行特征的高质量小鼠模型，对推进对肌萎缩侧索硬化症的理解和开发新的治疗策略至关重要。
PCDHA9是原始粘附蛋白cadherin超家族中的一个分支成员，属于PCDHα家族。这一家族还包含PCDHβ和PCDHγ亚家族，其成员主要在中枢神经系统中表达。原始粘附蛋白在形成功能性神经回路时起到类似“神经元条形码”的作用，关键在于调节神经元的自我识别和相互排斥。这些蛋白构成了cadherin超家族中最大的一个亚群。
在小鼠中，PCDH-α家族包含十四个成员，其中α1至α12在单个神经元中随机表达，而αc1和αc2的表达则是固定的。所有成员在C-末端共享一个相同的恒定结构域，而在N-末端则有一系列高度相似的可变结构域（由重复的细胞外cadherin [EC]结构域组成）。
PCDH基因簇的核苷酸变异和DNA甲基化模式的异常与多种神经发育异常（如唐氏综合征）、精神障碍（如自闭症）及先天性心脏病（CHD）关联。虽然人类Hirschsprung病中发现了PCDHA9的变异，并且小鼠研究表明Pcdhα9的突变可能促进先天性心脏病（CHD）的发生，但目前关于PCDH-α家族与这些疾病的直接因果关系的证据还相对有限。
从分子机理上，我们的研究发现Pcdha9基因的突变导致了老龄小鼠脊髓中非整合素依赖性蛋白激酶FAK和PYK2的异常活化，并且显著抑制了运动神经元中钠钾泵α1亚单位（NKA-α1）的表达。通过单细胞多组学分析，我们进一步揭示了在老龄突变小鼠中细胞粘附、离子传输、突触组装以及神经元生存相关的信号传导途径的干扰。
在本研究中，我们在一批中国肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者中发现了PCDHA9基因（c.2099T>C; p.Leu700Pro）的一个高频率纯合突变。我们制造了携带该基因同位突变的纯合错义变异与移码缺失小鼠模型，研究发现Pcdhα9对运动神经元的生存和神经肌肉接头（NMJ）的稳定至关重要。这些小鼠展示了与肌萎缩侧索硬化症相似的临床特征，这些发现支持PCDHA9可能与肌萎缩侧索硬化症的发病机理相关。
我们进一步观察到，与肌萎缩侧索硬化症相关的L700P变异导致PCDHA9蛋白的不稳定，并减少了其与Na+/K+ ATPase-α1这一相互作用蛋白的水平。通过对突变小鼠脊髓组织的多组学分析，我们发现了与细胞粘附、离子传输和神经元生存相关基因和蛋白表达的显著失调。
总体而言，我们不仅在肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者中识别了PCDHA9的变异，还通过小鼠模型验证了这些变异在疾病中的作用，为理解肌萎缩侧索硬化症的病理机制提供了新的见解。
结果
在中国散发性肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者中发现罕见有害的PCDHA9同型纯合变异
为了筛查肌萎缩侧索硬化症的突变，
我们对中国西部华西医院154名无关的散发性肌萎缩侧索硬化症患者和102名健康对照进行了全外显子组测序（WES）
。我们识别了404,047个变异，包括368,143个单核苷酸变异（SNVs）和35,904个插入或缺失（Indels），预测会改变蛋白质编码序列。在所有单核苷酸变异（SNVs）中，有39,178个被归类为罕见有害变异（RDVs）。此外，我们在肌萎缩侧索硬化症中未报道的编码序列中发现110个基因携带2个或更多罕见有害变异。然后，我们设计了一个包含这110个基因和178个先前报告与肌萎缩侧索硬化症相关性的不同证据的基因（已知肌萎缩侧索硬化症基因、全基因组关联研究、全外显子组测序、功能等）的288个候选基因定制panel。我们通过超深度目标测序分析了392名肌萎缩侧索硬化症患者和328名对照（包括全外显子组测序研究的病例和对照样本）的基因组。我们识别了11,076个单核苷酸变异，包括6335个罕见非同义变异，其中3139个预测为有害。在392名（10.5%）患者中，41名携带18个已知肌萎缩侧索硬化症基因中的一个或多个突变，其中SOD1是突变最多的基因。考虑到双等位变异的低背景率，并且因为在隐性模型下表征致病基因所需的样本量要比显性模型下小得多，我们寻求优先考虑在未描述基因中的双等位罕见有害变异（同型纯合或复合杂合）。有趣的是，在288个目标基因中，我们发现三个无关病例携带PCDHA9基因中的同型纯合c.2099T>C（p.Leu700Pro; rs782621196）变异（图1a-c）。此外，我们在一个患者中发现LAMC3（c.1330C>T;p.R444C;c.2438G>T;p.S813I）的复合杂合变异，以及在另一个患者中发现RP1L1（c.455G>A,p.R152Q;c.199G>A,p.E67K）的复合杂合变异。然而，这些变异在肌萎缩侧索硬化症患者中并不常见，与疾病的相关性并不明显。隐性LAMC3突变被报道会导致枕部皮层发育过程中的畸形，大多数是失活（终止或移码）变异。此外，根据ACMG/AMP分类指南，c.2438G>T（p.S813I）变异被确定为良性或可能良性，而c.1330C>T（p.R444C）被确定为VUS。在RP1L1中，c.455G>A（p.R152Q）和c.199G>A（p.E67K）都被确定为VUS。
PCDHα基因簇包含多个可变外显子，编码六个胞外钙黏蛋白结构域（ECD1-6）、一个跨膜结构域（TM）和三个特定于簇的“恒定”外显子，编码一个共有的细胞内结构域（ICD）。PCDHA9的前mRNA是通过顺式剪接将变异外显子9和三个恒定外显子连接生成的。在当前研究中，我们在这个基因的病例中识别了19个罕见编码变异，其中L700P变异是最常见的。更重要的是，我们在3个病例中检测到了同型纯合的L700P变异，但在对照组中未检测到。该变异位于TM结构域（图1b）。根据ACMG/AMP指南（2015）的基因变异评估，它是一个VUS（PM2_supporting+PP1_Moderate+PS3_Moderate）变异。然而，根据ClinGen贝叶斯分类框架（https://www.acgs.uk.com/quality/best-practice-guidelines/#VariantGuidelines），该变异获得了5分，非常接近于可能致病变异的标准（6分）。目前，由于所有3个无关患者已故的父母的DNA样本都不可用，因此无法获得变异在其父母中的反式分布证据，难以将此变异分类为可能致病或致病变异。
然而，在对额外的肌萎缩侧索硬化症病例进行Sanger测序时，我们在548个中国北方病例和从中国南方广东省招募的375个病例中没有检测到同型纯合变异。在我们的内部WES数据库的14,154个样本中，我们确定了14个杂合体（0.00049），但没有同型纯合体。gnomAD v2.1.1 WES数据库仅在9191个东亚人中报告了2个这种变异的杂合体（MAF=0.0001088），但在其他人群中没有（http://gnomad-sg.org/variant/5-140230179-T-C?dataset=gnomad_r2_1）。同样，gnomAD v3.1.1 WGS数据库仅在2592个东亚人中报告了1个杂合体（MAF=0.0001929），在其他人群中没有（http://gnomad-sg.org/variant/5-140850594-T-C?dataset=gnomad_r3）。此外，同型纯合的L700P变异在任何数据库中都没有被索引。在我们的研究中，同型纯合变异在三个无关家庭的病例中被确认，我们推测它可能是肌萎缩侧索硬化症的一种罕见突变。
所有纯合突变携带者相对早期（36-42岁）出现肢体无力，并且存活不超过4年。自病发起，所有患者均表现出不对称且逐渐加剧的四肢和延髓肌肉的无力和萎缩，至少在身体的四个区域中的三个（延髓、颈部、胸部和腰骶部）出现上运动神经元（UMN）和下运动神经元（LMN）的体征。肌电图（EMG）数据显示包括自发活动和运动单位电位的持续时间和幅度增加等异常。根据黄金海岸（GC）ALS57诊断标准，所有这些患者都被诊断为明确的肌萎缩侧索硬化症（ALS）。在遗传学上，他们对所有其他肌萎缩侧索硬化症基因都呈阴性，并且排除了与疾病相关的其他未知基因的显性或隐性变异。这三个纯合突变携带者的父母要么来自近亲婚配（家庭2），要么来自居住距离接近（家庭1和3，<2公里）的家庭。这些患者的父母和其他家庭成员并未发展出明显的肌萎缩侧索硬化症症状（无力、脊髓或延髓肌肉萎缩）。
生成PCDHA9突变和缺失小鼠模型以研究其在肌萎缩侧索硬化症（ALS）中的致病性
为了建立PCDHA9变异在肌萎缩侧索硬化症（ALS）中的致病性证据，我们基于这种在小鼠和人类之间高度保守的L700P突变，生成了突变小鼠。我们利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，针对小鼠中的PCDHA9同源基因，生成了携带错义突变的纯合小鼠（突变型，Pcdha9L729P/L729P），对应于人类的p.L700P（c.2185T>C），或者一个单碱基缺失（c.2166delA），导致p.M723WfsTer119（缺失型，Pcdha9M723Wfs/M723Wfs），这个缺失造成了蛋白跨膜域的大部分和整个细胞内域的框架移位和截断（图S1b,c）。定量实时PCR分析显示，缺失型小鼠的Pcdhα9 mRNA水平显著下降，这与无义介导的降解作用一致，但在突变型小鼠中并未观察到这种现象。使用缺失型小鼠系来检查PCDHA9功能丧失是否会导致类似于Pcdhα9L729P突变型的表型。
Pcdha9
突变和缺失小鼠表现出逐渐加重的运动功能缺陷
这两种小鼠的体重在7个月大左右达到顶峰后开始下降，到了12个月时下降变得显著。大多数小鼠出现了脊柱弯曲（驼背），并在14个月时瘫痪；瘫痪通常从一侧开始，一次影响一侧的肢体（图2a）。一些严重瘫痪的小鼠（生活在SPF环境中）在瘫痪发作后2周内死亡，导致其存活率显著低于对照组（图2b）。
然后，我们对突变动物进行了一系列行为测试（在无菌级别的实验室中）。足迹测试显示，从4个月大开始，突变和缺失小鼠后肢支撑时的步幅略短。这种表型在8个月大时变得明显，并随着年龄的增长而加剧（图2c、d）。到了12个月大，突变小鼠的步态严重异常。伴随着异常步态，前臂和四肢握力在12个月大时变弱，但在10个月或更年轻时并不显著（图2e）。在12个月大时，突变和缺失小鼠在旋转木马测试中表现出显著的运动功能缺陷，而缺失小鼠在10个月大时就比突变小鼠更早出现缺陷（图2f）。此外，这两种小鼠在12个月大时的游泳测试中也表现出肢体协调缺陷（图2g）。当小鼠被尾巴悬挂时，突变小鼠频繁表现出异常的爪子动作和后肢过度伸展（图2h）。有趣的是，我们注意到在16个月大的杂合突变型和野生型雄性小鼠之间，在旋转木马和游泳测试中存在差异，但在握力测试中则没有。这意味着Pcdha9杂合点突变可能会影响老年小鼠的运动功能，尽管这种影响出现得比较晚。
总的来说，上述结果证明了Pcdha9突变小鼠运动功能障碍表型的逐渐加重性。值得一提的是，用于SPF条件下存活测试的突变和缺失小鼠存活时间比在无菌级别实验室中进行行为测试的小鼠要长。因此，环境因素可能会对行为表型产生影响。
神经源性骨骼肌肉萎缩在突变和缺失小鼠中均有表现
突变和缺失小鼠逐步进展的运动功能障碍使我们开始分析它们的骨骼肌，尤其是腓肠肌，这是后肢中最大和最表面的骨骼肌。突变和缺失小鼠展现出严重的肌肉消耗。与13个月大的对照组相比，肌肉的大小和重量显著减少（图3a）。我们检测到有核心居中的萎缩肌细胞，这在14个月大的小鼠中比12个月大的更为明显（图3b）。萎缩的肌纤维表明肌肉萎缩是神经源性的（图3b）。
我们进行了肌电图（EMG）评估，并在13个月大的突变小鼠的肌肉中（包括肩三角肌、斜方肌背部肌和直股肌）检测到大量的阳性尖锐波、纤维震颤、自发性和巨大的运动单位电位，这些电位对应于多个脊髓段，而在野生型同窝小鼠中几乎检测不到（图3c）。此外，检测到的自发电位在每块肌肉的两侧并不对称。这些数据表明，广泛的骨骼肌肉萎缩和终末期衰竭是由神经源性损伤引起的，这些是肌萎缩侧索硬化症（ALS）在人类中的典型特征和基本诊断标准。
脊髓中运动神经元的丧失和神经肌肉接头的异常
我们继续检查腰椎脊髓（L3-L5区域）腹角的运动神经元。在12个月大的突变小鼠中检测到显著的CHAT+运动神经元丧失，但在10个月大的小鼠中没有变化（图4a）。同时也检测到腹角中总神经元（NeuN+）的减少，尽管这种减少的程度没有CHAT+神经元那么显著。与此同时，运动神经元附近的GFAP阳性细胞强度显著增加（图4b），这表明反应性星形胶质细胞的增生。
然后我们使用RNAscope®探针进行原位杂交试验，并在野生型小鼠腰椎脊髓中发现运动神经元（由CHAT探针标记）强烈表达Pcdhα9（图4c），这表明Pcdhα9在运动神经元中有特定的功能。
为了进一步了解肌肉萎缩、运动功能障碍和瘫痪，我们检查了13个月大小鼠半腱肌中的骨骼肌NMJs的完整性。我们使用α-布加毒素（α-BTX）染色来识别突触后位点的乙酰胆碱受体（AChR）簇（运动端板）。在突变和缺失小鼠中单个NMJ面积显著减少。在突触前水平（NF-200）对NMJ的分析揭示了突变和缺失小鼠中有显著更多的突触前位点显得暗淡、较弱或甚至失去神经支配（图4d）。这些异常的NMJ结构可能会破坏突触连接并导致突触传输缺陷。我们还检查了6个月大小鼠的NMJ，发现在这个阶段野生型和突变小鼠之间那些非支配和弱AChR NMJ之间没有显著差异。
我们还在13个月大的小鼠中对坐骨神经进行了甲苯胺蓝染色追踪。突变小鼠在薄的轴突（d<20像素，1μm=30像素）中显著增多，并在大直径轴突（d>70像素）中减少（图4e）。这表明轴突的退行或再生，以及较少的大口径α-轴突。在13个月时，透射电子显微镜也检测到大轴突的减少，但并未发现纤维髓鞘的缺陷。然而，我们并未在脊髓中观察到任何显著的髓鞘缺陷，正如Blackgold II染色所示。
更重要的是，我们在12个月大突变小鼠的腹侧脊髓运动神经元中观察到TDP-43的病理特征。虽然在年老的野生型小鼠的运动神经元细胞质中发现了TDP-43聚集，但我们能在核内检测到明显的TDP-43表达。然而，在突变腹侧脊髓中，TDP-43在运动神经元的核内几乎无法检测到，而TDP-43在细胞质中大量积累（图4f）。值得注意的是，脊髓运动神经元中的TDP-43病理学是肌萎缩侧索硬化症（ALS）的一个几乎普遍的神经病理学标志59,60。
上述结果表明，我们年老的突变和缺失小鼠展现出典型的肌萎缩侧索硬化症（ALS）样表型，包括由脊髓运动神经元丧失（伴随星形胶质细胞激活）导致的生存和运动功能的逐渐衰退，显著的肌肉萎缩，以及NMJ的结构、功能异常。运动神经元丧失和NMJ异常可能会导致骨骼肌的神经源性萎缩（图4g）。
人类PCDHA9 L700P突变导致其不稳定和功能障碍
为了解析Mutmice遗传病理机制，我们对12个月大的小鼠脊髓前角进行了显微解剖，并进行了串联质谱标记（TMT）标记的定量蛋白质组分析，比较了WT（野生型）和Mutmice（突变型）之间的蛋白质水平。WT（野生型）和Mutmice（突变型）之间有164种蛋白的水平发生了显著变化。对这些蛋白进行基因本体（GO）分析表明，（离子）传输和细胞或细胞-细胞粘附的功能被显著扰乱（图5a，b）。其他受扰乱的功能包括对细胞因子的反应、衰老、线粒体自噬、神经脉冲传输、表观遗传基因调控和凋亡等。
由于PCDHA9是PCDHα家族的成员，该家族在神经回路组装期间的细胞-细胞粘附中发挥作用，因此我们探讨了L700P突变对PCDHA9的影响，我们在HEK293细胞中表达了野生型人类PCDHA9（hPCDHA9）或其突变体（hPCDHA9 L700P）。hPCDHA9突变体的蛋白水平低于WT（野生型），而mRNA水平相似（图6a-c）。我们还通过用hPCDHA9抗体对活细胞染色，测试了它们在细胞膜上的表达，并发现在表达hPCDHA9 L700P的细胞中信号也明显较弱（图6b）。当细胞用蛋白合成抑制剂环己酰胺（CHX）处理时，我们检测到突变型hPCDHA9的半衰期大大缩短（图6d）。同时，用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞，导致突变型hPCDHA9的表达显著升高（图6e）。这些结果表明，人类PCDHA9的L700P突变导致稳定性下降和降解增加。
过量表达PCDHα-C2和PCDH-γ-C5蛋白被报道与PYK2和FAK（焦点粘附激酶）家族成员相互作用并抑制其活性，通过它们在家族中共有的C-末端61。在小鼠中删除Pcdh-γ家族或在斑马鱼中删除Pcdh-α家族，被显示能诱导神经元凋亡62,63。由删除整个Pcdh-γ家族所致的神经元死亡可能是由于在小鼠脊髓中PYK2和FAK活性的上调61。因此，我们在HEK293细胞中共表达hPCDHA9和FAK或PYK2，验证了hPCDHA9与PYK2的相互作用（图6f）。我们发现，FAK和PYK2的磷酸化水平被野生型hPCDHA9显著抑制，但不被突变型hPCDHA9抑制（图6g，h）。重要的是，在12月龄的Mutmice（突变型）脊髓中，FAK的磷酸化水平显著增加，并且PYK2的磷酸化水平也有上升趋势（图6i）。这些结果表明，在我们的Mutmice（突变型）脊髓中，FAK和PYK2的异常激活可能有助于神经元损失。
PCDHA9
突变导致脊髓运动神经元中Na+/K+ ATPase-α1的表达降低
由于在上述基因本体（GO）分析中，（离子）传输功能受到的干扰最为显著，我们检查了参与离子传输的膜蛋白的表达情况。Na+/K+ ATPase-α1（NKA-α1），作为Na+/K+ ATPase-α家族的成员，对于维持神经元膜上的钠和钾梯度及细胞存活至关重要。我们使用NKA-α1作为质膜标记，并发现它与hPCDHA9共定位（图7a）。这表明hPCDHA9与NKA-α1相互作用。为了验证这一点，我们进行了共免疫沉淀实验，表达在HEK293细胞中的Flag-hPCDHA9，并在免疫复合物中检测到了内源性NKA-α1的存在（图7b）。然后我们检查了小鼠脊髓中NKA-α1的表达。如图7c,e所示，它在HB9-GFP和CHAT阳性的运动神经元中选择性地高度表达。在检查12个月大的小鼠脊髓中的NKA-α1蛋白水平时，我们发现在Mutmice（突变型）中显著降低（图7d）。同时，免疫染色显示Mutmice（突变型）中的运动神经元NKA-α1水平较低（图7c,e）。
NKA-α的功能核心是α/β异源二聚体，通常与FXYD家族的小跨膜蛋白结合，形成异源三聚体复合物（α/β/FXYD）。我们检查了Na+/K+ ATPase α3和β1（NKA-α3和β1）的表达，并发现它们在12个月大的Mutmice（突变型）的脊髓中并未发生显著变化。上述结果表明，由PCDHA9突变引起的NKA-α1表达减少可能使脊髓运动神经元更加脆弱。
单细胞RNA测序和ATAC测序来定义Pcdha9突变小鼠的缺陷
为了解密潜在的病理机制并在运动功能障碍发生前定义不同的基因表达程序，我们再次从Pcdha9突变（Mut）小鼠及其野生型（WT）同窝小鼠的脊髓腹角处进行了显微解剖，并对9个月大的小鼠细胞进行了单细胞RNA测序（snRNA-seq）和单细胞转座酶可达染色质测序（snATAC-seq）。经过质量控制，我们分别在snRNA-seq中获得了21756个细胞，在snATAC-seq中获取了14095个细胞，将这些细胞分为5个簇（图8a）。每个簇根据snRNA-seq数据集中的mRNA水平或在snATAC-seq数据集中的基因得分定义，并由已知的标志基因标记（图8a，b）。我们采用了t分布随机邻居嵌入（t-SNE）分析和统一流形近似和投影（UMAP）来可视化识别的各种细胞，包括神经元、寡突胶质细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和寡突胶质细胞祖细胞（OPC）（图8a）。
