来源：好本子
NAT10 介导的 ac4C 乙酰化驱动的 m6A 修饰通过参与 YTHDC1-LDHA/PFKM 调节糖酵解并促进骨肉瘤
图源：Cell Communication and Signaling
1、这篇文章首先确定了 N4-乙酰胞嘧啶（ac4C）乙酰化的关键酶 NAT10 在人骨肉瘤组织中高度表达，其敲除增强了 m6A 含量并显着抑制了骨肉瘤细胞的生长、迁移和侵袭；
2、本文的创新性主要在于：①首次证明 ac4C 驱动的 RNA m6A 修饰可以正向调节癌细胞的糖酵解，并揭示了骨肉瘤中 NAT10/ac4C-YTHDC1/m6A-LDHA/PFKM 以前未被识别的信号轴；②首次揭示了 NAT10 介导的 YTHDC1 mRNA 衰变部分是由于其 mRNA 转录本的稳定性降低，导致蛋白质翻译的抑制和骨肉瘤细胞生长的抑制。
研究背景
骨肉瘤是最常见的原发性骨恶性肿瘤，其特征是高度恶性肿瘤和不良预后，转移后的 5 年生存率低于 20% 。因此，探索骨肉瘤发展和进展的分子机制对于开发新的治疗策略至关重要。RNA N6-甲基腺苷（m6A）在癌症进展过程中的动态变化参与各种细胞过程。然而，关于上游调节因子与 m6A 修饰之间可能的直接联系知之甚少，因此会影响致癌进展。
研究思路
研究结果
Ac4C 调节 YTHDC1 的 mRNA 稳定性和翻译
如图 1A 所示，通过 qRT-PCR 证实了 NAT10 siRNA 在 U2OS 和 143B 细胞中的转染效率。RNA 斑点印迹结果显示，转染 NAT10 siRNA 后，骨肉瘤细胞中 ac4C 含量显著降低。Elisa 检测显示出 m6A 含量的变化，与 NC 组相比，敲除 NAT10 后的 m6A 含量显著增加。接下来，研究者们用 PACES 预测了 YTHDC1 mRNA 中的 ac4C 乙酰化位点。用 qRT-PCR 检测 NAT10 后 U2OS 和 143B 骨肉瘤细胞系中 YTHDC1TemRNA 的表达水平。
此外对 YTHDC1 进行了基因特异性 ac4C qPCR，证实了 YTHDC1 转录本中 ac4C 水平的降低。为了进一步探索 NAT10 调控 YTHDC1 转录本表达的潜在机制，研究者发现在 143B 细胞中，与 siNC 组相比，在存在转录抑制剂放线菌素 D（行为 D）时，siNAT10 抑制了 YTHDC1 mRNA 的稳定性。同时，在翻译抑制剂环己酰亚胺（CHX）的存在下，siNAT10 加速了 YTHDC1 的降解，NAT10 沉默确实导致 YTHDC1 转录本的半衰期显著降低。
图 1 Ac4C 调节 mRNA 稳定性和 YTHDC1 的翻译
NAT10 依赖性 ac4C 乙酰化影响骨肉瘤细胞的生长和运动
与正常骨组织相比，NAT10 蛋白的表达明显高于正常骨组织。来自 TCGA 数据集的 Kaplan-Meier 生存分析显示，NAT10 低表达的肉瘤患者表现出较高的生存率，而 NAT10 高表达的肉瘤患者表现出较差的生存率。接着检测了 NAT10 对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果显示，NAT10 的缺失降低了 U2OS 和 143B 骨肉瘤细胞的集落形成能力。此外，在 EdU 染色、transwell 细胞侵袭和伤口愈合细胞迁移实验中，下调 NAT10 显著抑制了 U2OS 和 143B 细胞的增殖、侵袭和迁移能力。结果表明，NAT10 在体外影响细胞增殖、迁移和血管生成。
图 2 NAT10 依赖性 ac4C 乙酰化影响骨肉瘤细胞的生长和运动
Ac4C 乙酰化调节骨肉瘤细胞的糖酵解
与先前预期相吻合，当在 143B 及 U2OS 细胞内实施 NAT10 的敲除操作时，观察到葡萄糖浓度显著上升，而乳酸与丙酮酸的生成量则普遍呈现下降趋势。进一步通过 qRT-PCR 技术分析，揭示了在上述两种细胞中，NAT10 的缺失导致了与糖酵解途径紧密相关的基因，特别是 PFKM 与 LDHA，其 mRNA 表达水平发生了不同程度的下调。随后，在蛋白质层面进行的验证实验也确认了 PFKM 与 LDH 活性的相应减少，与 mRNA 水平变化一致。这些综合发现强调了 NAT10 作为 ac4C 乙酰化的关键酶，在介导骨肉瘤细胞的糖酵解中发挥作用。
图 3 ac4C 乙酰化调节骨肉瘤细胞的糖酵解
YTHDC1 介导的 m6A 甲基化影响骨肉瘤细胞生长并调节糖酵解途径
基于 TCGA 数据库的信息，Kaplan-Meier 生存分析揭示了 YTHDC1 基因的低表达状态与肉瘤患者预后改善之间的显著关联。研究团队进一步在 mRNA 转录及蛋白质层面确认了 YTHDC1 表达抑制的效率。值得注意的是，在 U2OS 与 143B 骨肉瘤细胞模型中，YTHDC1 的敲除操作显著遏制了细胞的生长速率、增殖能力及迁移活性。
尤为引人关注的是，当 YTHDC1 被敲除后，对细胞培养环境中葡萄糖残余量及细胞内乳酸、丙酮酸浓度的检测结果显示出与假设相符的变化趋势。具体而言，与 siNC 对照组相比，143B 与 U2OS 细胞在 YTHDC1 缺失条件下，乳酸生成量与丙酮酸含量均有所减少。同时，这两种细胞系在 YTHDC1 表达下调后，均展现出增强的葡萄糖摄取能力。综上所述，这些发现表明，NAT10 通过 YTHDC1 介导的 m6A 甲基化影响骨肉瘤细胞的生长，并调节糖酵解途径。
图 4 YTHDC1 介导的 m6A 甲基化影响骨肉瘤细胞生长并调节糖酵解途径
YTHDC1 识别 PFKM 和 LDHA RNA 上的差异 m6A
随后，利用序列导向的 SRAMP 工具预测 m6A 修饰位点，识别出 PFKM 与 LDHA 基因的 mRNA 序列中存在多个潜在的 m6A 修饰候选位点。通过 RIP-PCR 实验验证，确认了 PFKM 和 LDHA 能够特异性地与 YTHDC1 蛋白发生相互作用。进一步地，在 143B 和 U2OS 细胞系中，YTHDC1 不仅在 mRNA 层面，也在蛋白质层面有效抑制了 PFKM 和 LDHA 的表达。
为了深入探究 YTHDC1 调控 PFKM 和 LDHA 表达的分子机制，研究团队采用了放线菌素 D（Act D）及蛋白合成阻断剂放线菌素 CHX，分别处理正常对照（NC）与 YTHDC1 敲除的 143B 细胞，并量化了 PFKM 和 LDHA 转录本的半衰期及其 mRNA 的稳定性。结果显示，YTHDC1 的沉默显著缩短了这两种转录本的半衰期，这一发现强调了 YTHDC1 在识别 PFKM 和 LDHA RNA 上的双向 m6A 修饰中的关键作用，进而影响了它们的稳定性及后续的翻译效率。
图 5 YTHDC1 识别 PFKM 和 LDHA RNA 上的差异 m6A
YTHDC1 部分消除了 NAT10 敲低对体内肿瘤生长的抑制作用
为了获得更确凿的证据，证明 NAT10 和 YTHDC1 对肿瘤生长的影响，研究者们通过慢病毒转染 143B 细胞构建了稳定的 NAT10 敲除和对照细胞。一部分 NAT10 敲低细胞也转染了 YTHDC1 过表达的慢病毒，并用于建立动物异种移植模型。通过 WB 分析证实 shNAT10 和 YTHDC1 的慢病毒感染效率。结果表明，与转染空慢病毒衍生的小鼠相比，接种慢病毒稳定 NAT10 敲低细胞的小鼠的肿瘤体积和癌组织重量显着降低。同样，不同治疗组的苏木精和伊红（H&E）染色也进一步支持了这些治疗效果。
研究发现，在转录抑制剂放线菌素 D 存在的情况下，慢病毒过表达 YTHDC1 部分消除了慢病毒消耗 NAT10 导致的其稳定性降低（ActD）。慢病毒过表达 YTHDC1 部分消除了 lenti-shNAT10 敲低导致的 YTHDC1 mRNA 和蛋白的稳定性降低。此外，在集落形成实验中，慢病毒消耗 NAT10 显著抑制了 U2OS 和 143B 骨肉瘤细胞的集落形成能力，慢病毒过表达 YTHDC1 显著消除了这种缺陷。
图 6 YTHDC1 部分消除了 NAT10 敲低对体内肿瘤生长的抑制作用
文章小结
总之，本研究：①将 ac4C 乙酰化修饰与 m6A 甲基化修饰联系起来，为人类癌症的表观遗传调控提供了新的见解；②表明 ac4C 驱动的 RNA m6A 修饰在骨肉瘤发展中的关键作用，其特征是诱导骨肉瘤细胞中的糖酵解过程；③揭示了骨肉瘤中 NAT10/ac4C-YTHDC1/m6A-LDHA/PFKM 以前未识别的信号轴，表明重编程 RNA m6A 甲基化是骨肉瘤治疗的潜在且有前途的策略，并为骨肉瘤发展的分子机制提供了深刻的见解。
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