RNAi药物，谁将脱颖而出？

2017年9月21日，美国生物技术公司Alnylam宣布其RNAi药物Patisiran在一个家族性淀粉样多发性神经病变(FAP)三期临床达到一级、二级终点，这是RNAi药物首次在三期临床达到主要临床终点。这个名为Apollo的试验招募225名患者，使用18个月一级终点mNIS+7和二级终点Norfolk QoL都显著下降，显示该药物不仅减缓疾病恶化，还可能逆转疾病。用药组和安慰剂组退出率分别为7.4和37.7%，也说明用药组疗效显著。两组死亡率分别为4.7%和7.8%，但似乎未达到统计显著。最重要的是Patisiran似乎没有遇到困扰RNA药物的安全性问题，具体数据要在11月的会议公布。受此消息影响ALNY股票当天上扬52%，而竞争对手Ionis下滑9%。

Mechanism of RNA interference and miRNA in mammalian cells

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA (double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。RNAi是在研究秀丽新小杆线虫(C.elegans)反义RNA (antisense RNA)的过程中发现的，由dsRNA介导的同源RNA降解过程。此后dsRNA介导的RNAi现象陆续发现于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中，并逐渐证实植物中的转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)、共抑制(cosuppression)及RNA介导的病毒抗性、真菌的抑制(quelling)现象均属于RNAi在不同物种的表现形式。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。

2004年9月，《自然》首次刊登了美国科学家Andrew Z. Fire与Craig C. Mello等人撰写的关于RNA干扰的成果文章。时隔不久，RNAi技术取得了非凡的成就。人们逐渐意识到，RNAi将会对生物学的发展带来深远的影响。毫无疑问，打开了RNAi这一潘多拉盒子的Andrew Fire与Craig Mello获得了2006年的生理学或医学诺贝尔奖。诺贝尔委员会成员Goran Hansson在该年的颁奖词中说道：“RNAi为我们了解生命提供了新视角，并为医学发展提供了新工具。”

Chemical modifications of siRNAs

对于基于核苷酸的药物而言，其在体内发挥作用的最大障碍在于核酸酶的降解作用及内吞过程中药物分子从内吞体的逃逸。通过化学修饰，如增加2’甲氧基及LNAs等技术，可以提高药物分子的稳定性，延长其半衰期。除了通过化学修饰增加稳定性外，胶囊技术的拓展，也可以提高药物分子的输送效率。常用的输送系统包括脂质纳米粒，如中性脂肪乳剂或靶向部分连接的树状大分子复合物。对于药物输送系统，最大的挑战性在于潜在的免疫刺激作用及对病变区域靶向特异性的缺失。

Comparison of RNAi drug with two major classes of traditional pharmaceutical drugs—small molecules，and proteins and antibodies

相比于传统的小分子药物及蛋白类药物，RNAi类药物具有自身独特的优势，如上图所示。RNAi类药物可以做用于所有的靶点，包括一些目前认为不具有成药性的靶点，且先导分子能够被快速的确认和进行优化。对于小分子药物而言，最大的挑战在于如何找到具有高度选择性及治疗活性的化合物；这是一个耗时耗力的过程，并且对于很多靶点而言，成功遥不可期。而在RNAi药物开发领域，确定具有高度选择性和抑制活性的序列变得非常迅速高效，这一点已在很多药物靶点上得到了验证。而对于蛋白及抗体类药物而言，主要的技术挑战在于生产过程。对于蛋白类药物，细胞级别的生产往往得率较低，且蛋白本身往往会出现聚集变性等过程。与之相反，目前siRNAs可以通过化学合成方式获得，过程简单。另外，受限于作用原理，RNAi类药物只能是某些特定靶点的抑制剂，而小分子药物、蛋白类药物及抗体类药物既可以发挥抑制剂作用，又可以作为激活剂形式出现。总而言之，RNAi类药物是一类新颖的药物开发策略，有望成为现有药物体系的一类很好的补充。

本文即对目前进入临床2-3期研究的代表性RNAi药物做一简要综述，同时还包含了用于HCV治疗的miRNA类药物Miravirsen。上述以RNAi为主的寡核苷酸类药物的研发，有望为药物治疗市场开辟一片新天地。

Patisiran (ALN-TTR02)

2017年9月21日，ALNY (Alnylam Pharmaceuticals，Inc)制药公司和赛诺菲共同宣布，治疗遗传性hATTR淀粉样变性RNAi (RNA干扰)药物Patisiran到达主要有效终点以及所有次要终点，圆满完成名为APOLLO的临床III期试验。

家族性淀粉样多发性神经病变(FAP)是一种罕见的遗传缺陷，可导致破坏神经的致命蛋白累积。这个病不仅严重影响生活质量，而且也致死性很高，诊断后生存期低于15年。其中最常见的致病蛋白为甲状腺素运载蛋白(Transthyretin，TTR)。TTR有可能在神经、消化道、心脏和眼睛等地方累积。该疾病目前治疗方法非常有限，由于TTR大部分是经由肝脏而生成，因此在疾病早期可采用肝移植手术。这种疾病很难用传统药物控制，而RNA药物如Patisiran和Ionis的反义核酸(ASO)药物NEURO-TTR可以选择性降解TTR的mRNA避免毒性蛋白的合成。

Timeline of access to anti-amyloid therapies for patients with hereditary transthyretin amyloidosis with polyneuropathy

APOLLO临床III期试验是一项随机、双盲、安慰剂对照的全球研究，旨在评估Patisiran对遗传性hATTR淀粉样变性患者治疗的有效性和安全性。这项试验中，接受Patisiran治疗患者在治疗的第18个月时达到mNIS+7 (modified neuropathy impairment score，改良神经病变评分)。mNIS+7是一种通过评估感觉运动能力、神经传导、反射和自主功能评价神经损伤程度的的综合测量方法。这项研究的次要终点包括Norfolk QOL-DN生活质量评分、NIS-W运动强度评分、R-ODS残疾评分、10米步行测试、mBMI营养状况评分以及COMPASS-31自主状况评价。这项研究的探索性终点包括心功能改善程度、皮肤火箭检测淀粉样沉积以及神经纤维密度测量。在这项试验中，除了达到mNIS+7的主要终点外，接受治疗的患者也达到了预期的次要终点和探索性终点。

Alnylam Pharmaceuticals-Clinical development pipeline

基于这些积极的结果，Alnylam预计将于2017年底提交首个新药申请，并在不久后推出营销授权申请。从2018年上半年开始，Sanofi Genzyme目前正准备向日本、巴西和其他国家提交Patisiran的监管文件。在获得监管部门批准后，Alnylam将在美国，加拿大和西欧商业化Patisiran，而Sanofi Genzyme将在世界其他地区商业化该药物。

Pipeline of Quark Pharmaceuticals，Inc

Quark制药公司是一家致力于晚期临床阶段研究的制药公司，在发现和开发新型的基于RNAi疗法的药物研发中处于领先地位。公司有两类药物，QPI-1002和QPI-1007被授予孤儿药地位，目前正在开展全球三期临床研究，其适应症分别为移植肾功能延迟恢复(DGF)和非动脉炎性缺血性视神经损害(NAION)；PF-655处于临床二期研究阶段。

PF-04523655 (PF-655)

是一类合成的化学修饰后的siRNA，能够抑制Quark公司独有的靶点基因RTP801，后者为应激诱导的结构蛋白，可以抑制mTOR信号通路中TSC1/TSC2复合体上游的各项功能。靶点基因RTP801由Quark公司通过其BiFARTM靶点发现平台所发现。在缺血、缺氧或氧化应激压力下，RTP801的表达量会迅速上调。在激光诱导的脉络膜新生血管(CNV)的临床前动物模型玻璃体腔中注射PF-655会导致RTP801表达量因RNAi过程而发生的下调，并且没有TLR信号的激活、抗血管生成和神经营养因子的诱导表达，以及随后的脉络膜新生血管体积减少、血管渗漏和炎性细胞浸润为脉络现象的缓解。

PF-655的作用机制被认为与各类型的VEGF抑制剂类药物不同。对于动物模型中的脉络膜新生血管，当PF-655与VEGFR抑制剂联用时，能够提高效果并降低糖尿病小鼠视网膜中的血管渗漏。在RTP801基因敲除小鼠受氧诱导的视网膜病变模型中也观察到了在视网膜和视网膜新生血管形成减少，外核层细胞凋亡的衰减(早产儿视网膜病变)。病理过程的缓解同样出现在各种非眼部疾病模型的RTP801基因敲除小鼠中，包括香烟烟雾诱导的肺损伤和肺气肿，表明RTP801在急性和慢性应激性病理过程中具有更广泛的生理功能。

PF-655已进行了多项临床研究，包括针对糖尿病黄斑水肿(DME)的两项二期临床研究，以及用于治疗年龄相关性黄斑变性(AMD)的临床一期/二期研究。在代号为MONET用于治疗湿性年龄相关性黄斑变性的二期临床研究中，相比于前三个月，PF-655可显著改善平均视力水平；而该药物同Ranibizumab的联用效果比单独用药更佳。在代号为DEGAS用于治疗糖尿病黄斑水肿的二期临床研究中，相比于激光光凝治疗的对照组，PF-655对于患者视力的改善具有药物剂量依赖性。基于此项研究的结果，特别是视力改善与药物剂量间的相关性，一项Ⅱb期研究正在开展用以评估PF-655单独用药及与Ranibizumab联合用药对DME患者的治疗效果。

QPI-1002 (I5NP)

一类靶向于p53基因的siRNA类药物，也是第一个用于人体全身给药的siRNA药物。QPI-1002是一类合成的双链RNA寡核苷酸，对核酸酶具有抗性，设计用来通过RNA干扰的方式暂时抑制p53基因的表达。该药物的设计理念最早由Quark提出，其原理基于治疗性目的对p53基因的表达进行暂时及可逆性的抑制。p53是由DNA损伤、缺氧、氧化应激等条件激活的应激反应基因，诱导细胞周期阻滞、细胞衰老或凋亡。在急性损伤时，p53的暂时性抑制可减轻程序性细胞死亡，这可能有助于修复细胞损伤，从而保护组织和器官的完整性和功能。采用siRNA方式靶向p53基因的系统治疗方案，能显著改善多种临床前模型中的急性肾损伤，包括肾血管蒂钳、部分主动脉钳、顺铂诱导的急性肾损伤模型和肾移植的冷、冷缺血模型。

QPI-1002目前开展的临床研究包括用于预防死亡捐献者肾移植患者出现的移植肾功能延迟恢复(DGF)的Ⅰ/Ⅱ期临床研究，以及心脏手术后急性肾损伤的两项临床Ⅰ期研究。该药物目前已经获得美国FDA及欧洲EMA的孤儿药认定，并且DGF适应症获得了美国FDA的快速通道指定。针对预防和改善移植肾功能延迟恢复适应症，Quark目前正招募患者开展Ⅲ期临床研究(NCT02600296，QRK306)，预计将会招募634位患者。与此同时，Quark启动了一项II期研究用以预防心血管外科手术患者出现的急性肾损伤。

QPI-1007 and mRNA target sequences

QPI-1007

化学合成修饰的双链小干扰RNA，靶向于caspase2基因用以暂时性抑制caspase2基因的表达。该化学修饰的化合物由Quark公司开发，并受专利保护。独特的药物设计，使其具有高度特异性的RNAi活力，同时减弱了脱靶效应及免疫刺激反应。QPI-1007作为一种神经保护剂，用来治疗非动脉炎性前部缺血性视神经病变及其他诸如青光眼等视神经疾病导致的视网膜神经节细胞死亡(RGCs)。QPI-1007在非动脉炎性缺血性视神经病变治疗中的应用被美国FDA授予孤儿药地位。

细胞凋亡是视网膜神经节细胞(RGCs)死亡的主要原因，可导致非动脉炎性前部缺血性视神经病变及青光眼在内的视神经病变。Caspase2是促凋亡家族肽酶成员之一，地位独特，能够介导受体诱导型及线粒体型细胞凋亡。QPI-1007在动物模型中的研究表明：①Caspase2在视网膜神经节细胞中的激活；②玻璃体腔给药后视网膜神经节细胞中siRNA的摄取；③吸收后的药物以RNAi的方式发挥作用；④QPI-1007在四种视网膜神经节细胞损失动物模型中的治疗效果。

QPI-1007已在低视力的视神经萎缩患者及急性NAION患者中开展了临床Ⅰ/Ⅱa期研究(NCT01064505)，给药方式为单次玻璃体腔内注射。该研究在美国及以色列同时开展，目前已经结束。该药物同时也开展了一项随机双盲对照试验(NCT01965106)，用以评估对原发性急性闭角型青光眼的疗效。值得关注的是，2015年12月苏州瑞博生物技术有限公司与其战略合作伙伴美国Quark制药公司开发的小核酸药物QPI-1007在中国的国际多中心临床试验正式获得国家食品药品监督管理局(CFDA)批准开展II/III期关键性临床试验，令人期待。这也是中国第一个获批临床研究小核酸药物。

Schematic representation of a stable-nucleic-acid-lipidparticle (SNALP)

TKM-080301 (TKM-PLK1)

Arbutus Biopharma研发的一款靶向于PLK1的siRNA类药物，该激酶的过表达会促进肿瘤细胞失控性增殖。目前也有一些PLK1小分子抑制剂类药物进入了不同的人体临床研究阶段。TKM-080301以稳定脂质体颗粒形式(上图所示)用于静脉注射给药。

临床前研究详细评估了TKM-080301在体内外模型中的药理学活性、对免疫系统的效应及毒性。该药物可抑制肿瘤细胞的增殖，并能沉默掉PLK1基因；并在人类肿瘤细胞的异源抑制模型中表现出抗肿瘤活性。该药物的基因沉默效应也通过免疫组化及分子生物学手段得到了验证；单次给药引发的PLK1基因沉默可持续7-10天，且并未引发明显的免疫反应。针对TKM-080301开展的Ⅰ/Ⅱ期临床研究在晚期实体瘤或淋巴瘤，以及神经内分泌肿瘤(NET)或肾上腺皮质癌(ACC)患者中开展。由于PLK1在多种类型的癌症患者中存在表达量异常，因而该类别siRNA药物市场前景广阔。然而，PLK1是一类成药性较好的靶点，目前已有多种小分子抑制剂类药物处于不同临床研究阶段，如Volasertib等。因而，TKM-080301也面临诸多药物的竞争。

ATU027

Silence Therapeutics公司研发，一种化学合成的siRNA用以沉默掉PKN3基因，后者为PI3K信号下游分子。作为内皮调节性药物，ATU027可以稳定血管完整性、对抗肿瘤区域的炎症反应，并减少转移性肿瘤细胞的扩散。该药物的作用靶点为PKN3 mRNA上的5′-agacuugaggacuuccuggacaa-3′序列。ATU027为双链平末端，长度为23bp的寡核苷酸并经过了化学修饰；其给药形式为脂质体。

临床前研究表明，ATU027具有抗肿瘤活性，并能阻止肿瘤的肺部转移。一期临床研究(NCT00938574)在晚期难治性实体瘤患者中展开，用以评估ATU027单次或重复给药时的安全性、耐受性、药代动力学、药效学及抗肿瘤活性。ATU027还开展了另一项Ⅰ/Ⅱ期临床研究，用以评估在晚期或转移性胰腺癌患者中，该药物能否与标准化疗药物吉西他滨联合给药。在肿瘤治疗领域，胰腺癌一直是科学家们面临的最大挑战之一，具有很强的侵袭性和转移性。而现有的临床研究表明，ATU027同吉西他滨的联合用药可以提高晚期转移性胰腺癌的无进展生存率，有望为胰腺癌的治疗带来希望。

Pipelines of Sylentis

SYL040012 (Bamosiran)

靶向于β2肾上腺素受体的siRNA，用于青光眼的治疗。青光眼是一种引起视力损害的眼科疾病，由于进行性视神经损伤而导致失明。青光眼的主要危险因素是眼压升高、遗传和种族背景以及年龄。眼压升高则是由于水性成分的产生及排除两者间的失衡所造成。减少水性成分的产生和控制眼压的药物对青光眼患者是很有价值的。β-阻断剂产生这种效应，可以用于治疗青光眼。不同于阻断2肾上腺素受体的功能，另一种策略为通过RNA干扰方式敲低相应基因的mRNA表达量。SYL040012是一种合成的长度为21bp的siRNA，以裸露的形式存在，靶向于β2肾上腺素受体的mRNA。

在临床前研究中，SYL040012能特异性降低约50%的β2肾上腺素受体的mRNA，而对其他类型的肾上腺素受体则无显著效应。药物能够迅速进入眼睛并到达不同的结构组织中；并且只有少量非活性形式的药物会进入血浆和其他器官。眼部的特性十分有利于siRNA分子的给药，第一个进入临床研究的RNAi药物便是眼部疾病治疗领域。针对SYL040012分子开展的第一项临床一期研究(NCT 00990743)在眼压低于21mmHg的健康志愿者中评估了药物的安全性、耐受性及生物利用度，表现较佳。另有三项临床研究也已完成，分别是代号为NCT01227291的Ⅰ/Ⅱ期研究用以评估在未服药眼压升高患者中的药物耐受性及疗效；代号为NCT01739244的Ⅱ期研究用以评估SYL040012对高眼压症和开角型青光眼患者的耐受性及疗效；代号为NCT02250612的Ⅱ期研究，用以评估四种剂量的SYL040012滴眼液在降低开角型青光眼患者眼压中的疗效，并以0.5%马来酸噻吗洛尔作为对照。

SYL1001

是一类基于siRNA设计的用于预防和治疗眼痛及干眼综合征的药物，给药形式为滴眼液局部给药。干眼病的治疗对于眼科而言仍是一个巨大的挑战，目前常用的措施包括环孢菌素、消炎药，人工泪液和其他药物等。SYL1001本身并不能阻止发病过程，但却可以缓解患者所面临的眼部疼痛。SYL1001的受体是辣椒素受体TRPV1，一类存在于角膜及相应神经末梢的伤害性感受器。体外模型开展的临床前研究中，SYL1001表现出良好的安全性及疗效。目前针对SYL1001开展了两项临床Ⅱ期研究，分别为NCT01776658及NCT02455999用以评估其对眼痛伴干眼综合征患者的安全性及疗效。考虑到疼痛在其他眼科疾病中也是高频出现的一种临床症状，SYL1001的市场极为广阔。干眼症是一种治疗方法复杂的疾病，SYL1001只能用于镇痛和缓解症状，而不能替代免疫抑制剂类药物如环孢霉素及其他药物。因而，需要开展多中心的Ⅲ期临床研究用以评估在大量患者群体中，该siRNA药物是否还表现出良好的疗效及安全性。

Pipeline of Silenseed

siG12D-LODER

根据美国国家癌症研究所(NCI)的数据，美国2014年的胰腺癌新病例和死亡病例分别为46420和39590。胰腺导管腺癌是最常见的胰腺肿瘤，占胰腺癌病例的95%。它从细胞、形态和结构变化的递进级联演化，这与癌基因和肿瘤抑制基因的体细胞突变有关。最值得注意的是，几乎所有的胰腺导管腺癌包括KRAS基因突变，特别是一个叫做G12D突变。Silenseed公司所研发出的siG12D-LODER可释放出特异性的siRNA分子，能够在长达四个月的时间里，在胰腺癌患者体内降低或沉默KRAS G12D突变体的表达。体外模型及小鼠体内开展的临床前研究中，该药物表现出良好的疗效，能够有效诱导细胞凋亡从而遏制肿瘤的增长。2011至2013年，该药物开展了一项开放标签，多中心的I / IIa期临床研究，所招募患者为未经手术的局部晚期胰腺癌患者。在该研究中，siG12D-LODE表现出高度的安全性。疗效测试中，在肿瘤响应率、肿瘤标志物减少程度、转移时间、无进展生存率及总体生存率等方面，该药物均取得了令人鼓舞的初步结果。 

The role of miR-122 in HCV infection andantiviral action of Miravirsen

Miravirsen

2014年8月4日，罗氏(Roche)宣布收购丹麦制药商Santaris，该公司总部位于丹麦哥本哈根，是一家私人持有的生物制药公司，该公司开创的专有锁核酸(locked Nucleic Acid，LNA)平台，使RNA靶向治疗跨入了一个崭新的时代。Miravirsen是最早进入到临床研究阶段的miRNA药物之一，采用锁核苷酸(LNA)技术的一段15nt长度反义RNA链，可同miR-122的5’端互补治疗HCV感染。后者对宿主的侵染过程严重依赖肝脏中丰度最高的miR-122。在啮齿类及非人灵长类动物模型中的临床前研究表明，Miravirsen展现出良好的肝脏输送效率、胆固醇积累量降低及HCV滴度减小，并据此于2009年启动Ⅰ期临床试验。Ⅰ期临床结果同在非人灵长类动物模型中的结论一致，推动了Ⅱa期临床试验的开展。该项Ⅱa期研究在7个国际中心展开，研究人员评估了Miravirsen用于36例慢性HCV1型感染患者的安全性和有效性。试验表明Miravirsen用于慢性HCV1型感染患者表现出长期剂量依赖性地减少HCV RNA水平的效应，且未出现病毒抵抗性。值得关注的是，近期有报道表明，在体内外的测试中，随着Miravirsen使用剂量的提高，HCV病毒RNA的5’ UTR区域开始出现突变。虽然尚不清楚这些突变是否会导致抗药性的出现，对两者间相关性的分析迫在眉睫。

缩略词表：

ACC：adrenocorti calcarcinoma

ADRB2：adrenoceptor beta 2

AKI：acute kidney injury after cardiac surgery

AMD：Age-Related Macular Degeneration

ApoE：apolipoprotein E

CASP2：Caspase 2

DME：Diabetic Macular Edema

HCC：hepatocellular carcinoma

KRAS：Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog

LNA：locked nucleic acid

miR-122：microRNA 122

NAION：non-arteritic ischemic optic neuropathy

PKN3：protein kinase N3

PLK1：Polo-likekinase-1

TRPV1：transient receptor potential vanilloid 1

LNP：Lipid nanoparticle

PEG：Polyethylene glycol

PLGA：poly(lactic-co-glycolic)acid

RISC：RNA-induced silencing complex

RNAi：RNA interference

SNALPs：Stable nucleic acid lipid particles

参考文献：

1.ttps://en.wikipedia.org/wiki/RNA_interference

2.Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2007 Jun；6(6):443-53.

3.The Raceof 10 Synthetic RNAi-Based Drugs to the Pharmaceutical Market. Pharm Res. 2017Jul；34(7):1339-1363. doi:10.1007/s11095-017-2134-2.

4.RNAi therapeutics: a potential new class of pharmaceutical drugs. Nat Chem Biol.2006 Dec；2(12):711-9.

5.RNA interference in the clinic: challenges and future directions. Nat Rev Cancer.2011 Jan；11(1):59-67. doi:10.1038/nrc2966.

6.https://en.wikipedia.org/wiki/Transthyretin-related_hereditary_amyloidosis

7.Philip N.Hawkins，Yukio Ando，Angela Dispenzeri，Alejandra Gonzalez-Duarte，David Adams & Ole B. Suhr (2015): Evolving landscape in the management oftransthyretin amyloidosis，Annals ofMedicine，DOI: 10.3109/07853890.2015.1068949

8.http://quarkpharma.com/

9.http://www.sylentis.com

10.http://silenseed.com/